为什么蓝光和紫外线激发光源能激发GFP发出绿色荧光?

为什么蓝光和紫外线激发光源能激发GFP发出绿色荧光?

时间:2021-6-7 编辑:荧鸿科技

绿光蛋白GFP吸收的光谱峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于长波能量低,细胞忍受能力强,更适合活体检测,因此通常多使用蓝光波段光源(多为488nm)。GFP发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。

为什么蓝光和紫外线激发光源能激发GFP发出绿色荧光?

拓展:

荧光蛋白GFP发光原理

荧光蛋白发光类型属于斯托克斯位移型,其基本原理是生色团在较高能量的光子照射下发生构象的改变,从而导致分子能级变化,从高能级的构象跃迁向低能级时发出较低能量的光子。生色团在发光过程中主要有两种化学过程。一是质子转移,即质子化和去质子化,二是分子构象的改变。生色团主要有三种构象:A型、B型以 及中间过渡态Z 型。在分子构象变化的同 时还伴随着氢键的生成和断裂,以及电荷的传递去质子化和质子化的分子构象不同, 对应的分子能级也不同,从而其发射光谱中有两个特征峰,代表两种跃迁过程。质子化构象生色基团通过Tyr66 的脱质子状和质子化状态(酚羟基)的转换决定荧光发射。由于酚的激发态酸性远大于其基态, 故仅脱质子态的结构发射荧光。这个过程是十分迅速的,因此荧光蛋白发射的是荧光而不是磷光,需要激发光源持续存在才可连续发光。但是其极快的激发响应使得荧光蛋白适合作为高灵敏度生物探针以及生物成像材料。

荧光蛋白GFP发光特性

GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。在荧光显微镜下,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如荧光蛋白的应用非常的广泛,已经应用于分子标记,体内示踪,信号转导,药物筛选等生物科研的各个方面荧光让我们能够检测分子的构象变化,也能让我们追踪化学反应…. 是科学研究的重要手段之一。

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